RNA抽提的窍门
1:快速阻止 Rnase 活性 – 样品收集后快速冷冻,裂解时快速操作灭活 Rnase。
2:选择合适的抽提方法 – 高核酶含量的组织,脂肪组织最好用含苯酚的方法。
3:预判质量要求 – Northern,cDNA 文库构建对完整性要求高,RT-PCR, RPA (Ribonuclease protection assay) 对完整性要求不是很高。RT-PCR 对纯度 (酶抑制物残留) 要求很高。
4:彻底匀浆是提高得率和降低降解的关键。
5:检查 RNA 的完整性 – 电泳检测,28S:18S =2:1 是完整的标志,1:1 对大部分实验也是可以接受的。
6:去除 DNA – 用于 RT-PCR, array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。
7:降低外源酶的污染 – 不能从外面又导入酶。
8:低浓度的核酸浓缩时,要加入助沉淀试剂。但要防止助沉淀剂含酶及 DNA 污染。
9:彻底溶解 RNA,必要时可以 65C 加热 5 分钟。
10:合适的保存方法 – 短时间可以 –20C 保存,长期请保存于 –80C。
提高RNA得率
首先要意识到不同得样品其 RNA 含量差别很大。高丰度 (2-4ug/mg) 的如肝脏,胰腺,心脏,中丰度 (0.05-2ug/mg) 的如脑,胚胎,肾脏,肺,胸腺,卵巢,低丰度 (<0.05ug/mg) 的如膀胱,骨,脂肪。
1:裂解细胞使 RNA 释放出来 – RNA 如果不被释放出来,得率是会降低的。电动匀浆比其它匀浆方法效果更好,但也可能需要结合其它得方法,如液氮捣碎,酶消化 (Lysozyme/Lyticase)
2:抽提方法的优化。基于苯酚的方法的最大问题是分层不彻底和部分 RNA 的丢失(不能全部将上清取出)。分层不彻底是因为核酸和蛋白质含量高,可以用增加裂解液使用量或者降低样品量解决。脂肪组织要增加一步氯仿抽提。RNA 的丢失可以用反抽方法或者去除有机层后再离心的方法降低。基于柱离心式方法的最大问题是样品过量。
RNA抽提的窍门与提高得率分享
发布日期:2023/9/15 10:32:00
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