实验方法原理

　　转化活性是检测质粒生物活性的重要指标，在基因克隆技术中，转化（transformation）是特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组质粒 DNA（包括人工染色体）导入细胞的过程， 是一种常用的基本实验技术。 该过程的关键是受体细胞的遗传学特性及其所处的生理状态，用于转化的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，以防止对导入的外源的切割，用 R- M- 符号表示。 此外，为了便于检测，受体菌一般应具有可选择的标记（例如抗生素敏感性、颜色变化等）。 但质粒 DNA 能否进入受体细胞则取决于该细胞是否处于感受态（competence）。所谓感受态是指受体细胞处于容易吸收外源 DNA 的一种生理状态，可通过物理化学的方法诱导形成，也可自然形成（自然感受态）。 在基因工程技术中，通常是采用诱导的方法。 大肠杆菌是常用的受体菌，其感受态一般是通过用 CaCl2 在 0℃ 条件下处理细胞而形成，基本原理是： 细菌处于 0℃ 的 CaCl2 低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒 DNA 形成抗 DNase 的羟基一钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃ 短时间热激处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上便可获得所需的转化子。

　　实验材料 大肠杆菌PUC18 质粒

　　试剂、试剂盒 LB 液体培养基含（和不含）氨苄靑霉素的 LB 平板LB 培养基CaCl2

　　仪器、耗材 塑料离心管微量进样器玻璃涂棒恒温水浴锅（37℃42℃）分光光度计台式高速离心机

　　实验步骤

　　1. 制备感受态细胞

　　1.1 将大肠杆菌 HB101 在 LB 琼脂平板上划线，37℃ 培养 16～20 h。

　　1.2 在划线平板上挑一个单菌落于盛有 20 ml LB 培养基的 250 ml 三角瓶中，37℃ 振荡培养到细胞的 OD600 值为 0.3～0.5 之间，使细胞处于对数生长期或对数生长前期。

　　1.3 将培养物于冰溶中放置 10 min，然后转移到 2 个 10 ml 预冷的无菌离心管中，4000 r/min，0℃～4℃ 亡离心 10 min。

　　1.4 弃上清，倒置离心管 1 min， 流尽剩余液体后，置冰溶 10 min。

　　1.5 分别向二管加入 5 ml 用冰预冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液悬浮细胞， 置冰浴中 20 min。 CaCl2 的纯度至关重要，不同厂家，甚至同一厂家不同批号的产品，均影响感受态的形成。

　　1.6 4000 r/min，0℃～4℃ 离心 10 min 回收菌体， 弃上清。分别向二管各加入 1 ml 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液，重新悬浮细胞，

　　1.7 按每份 200 ul 分装细胞于无菌小塑料离心管中，如果不马上用可加入终浓度为 10％ 的无菌甘油，置 -20℃ 或 -70℃ 存备用。

　　制得的感受态细胞，如果在 4 ℃ 放置 12～24 h， 其转化率可增高 4～6 倍，但 24 h 后，转化率将下降。

　　以上均严格无菌操作。

　　2. 转化

　　2.1 加 10 ul 含约 0.5 ug 自制的 pUC18 质粒 DNA 到上述制备的 200 ul 感受态细胞中。 同时设三组对照：不加质粒；不加受体；加已知具有转化活性的质粒 DNA。具体操作参照下表进行。

　　2.2 将每组样品轻轻混匀后，冰浴 30～40 min， 然后置 42℃ 水浴热激 3 min， 迅速放回冰浴 1～2 min。

　　2.3 向每组样品中加入等体积的 2×LB 培养基，置 37℃ 保温 1～1.5 h， 让细菌中的质粒表达抗生素抗性蛋白。

　　2.4 每组各取 100 ul 混合物涂布于含氨苄青霉素（50 ug/ml）的选择平板上，室温下放置 20～30 min。

　　2.5 待菌液被琼脂吸收后，倒置平板于 37℃ 培养 12～16 h，观察结果。