当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键（thiocarbmide）结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般zui多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下：

FITC-N=C=S  +  N-H2-蛋白质  →  FITC-NS-C-N-H2-蛋白质

常用Marsshall（1958）法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等（1963）的透析标记法。

1.Marsshall法

（1）材料：抗体球蛋白溶液、0.5mol／L（pH9.0）碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7.2或3.0的0.01mol／LPBS等。

（2）方法及步骤   

①抗体的准备：取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使zui后免疫球蛋白浓度为20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上（速度适当以不起泡沫为宜）5～10min。

②荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0.01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。

a.蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。

b.总蛋白量（AXB）＝Crag。

c.C／20～C／10＝Dmg（如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20）。

d.荧光素FITC的量：（1／50～2／100）XC＝Emg。

e.巳0.5mol／L（pH9.5）碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。

f. PBS量D-（B+F）=Gml。

注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。

③结合（或标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁（大约在5—10min内加完），加完后，继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。

④透析：结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心（2500r／min）20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析（0～4~C）过夜。

⑤过柱：取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液：0.01mol／L磷酸盐缓冲液（pH7.2）；过滤量：12ml标记全球蛋白液（过滤前未透析）；收集量：20ml（稀释1.7倍左右）。

2.Chadwick法

（1）试剂和材料：抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、0.01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯（25ml）搅拌器、无菌吸管，无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml）透析袋等。

（2）方法及步骤

①抗体准备：用o～4~C的pH8。0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30～40mg／ml，置入25ml烧杯内，放于冰槽中。

②荧光色素准备：按每毫克免疫球蛋白加入荧光素0.01rug计算，称取所需的荧光素，用3％碳酸钠水溶液溶解。

③将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在o～4~C冰箱中结合（zui好在磁力搅拌机上持续搅拌）18～24h。

④透析和柱层析：方法同Marsshall法。

3.改良法

（1）试剂和材料

①0.01mol／L（pH7.2）PBS配法中，校定pH至7.2。NaCi 18g、Na2HP04 1.15g，溶于2000ml蒸馏水

②0.5mol／L（pH9.0）碳酸盐缓冲液配法  取0.5mol／LNazCOs（5.3％）10ml加入0.5mol／LNaHC03（4.2％）90ml，混合后，校定pH至9.0。

③3％碳酸钠水溶液配法  称L 5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。

④其他试剂和材料  l％叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯（25m1）、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500m1）透析袋等。

（2）方法及步骤   

①取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水（0.15mol／LNaCl）及缓冲液（0.5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9.0）稀释使每毫升内含蛋白质lOmg，缓冲液为总量的10％，降温至4℃。

②加入异硫氰酸盐（FITC）荧光素[蛋白：荧光素＝（50—80）mg/mg]，在0～4℃。

下电磁搅拌12～14h。

③然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵（用Nessler试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止）。

④将制备好的荧光抗体加叠氮化钠o.01％，分装在lml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中（4℃）可以用半年以上，一20~C保存可达2年以上。