悬浮培养指的是一种在受到不断搅动或摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系统，下面一起来了解一下悬浮细胞培养的操作步骤与注意事项。

　　一、步骤

　　1. 将准备好的冻存细胞放入37℃水浴中解冻。

　　2. 用70%乙醇对顶端进行消毒，用吸管将细胞转移到含有5mlwan全MEM-10培养基的25cm2组织培养瓶中，轻轻摇动培养瓶，使细胞均匀分布于培养瓶中，放入5%CO2加湿培养箱中37℃培养过夜。

　　3. 将培养基吸出，用0.5ml37℃的胰酶/EDTA覆盖细胞，消化30~40s。

　　4. 加入10ml旋转瓶wan全培养基-5，并将细胞转移至50ml的离心管中。室温1800g离心5min，弃上清。

　　5. 将细胞沉淀悬浮在5ml的旋转瓶wan全培养基-5中，上下吹打，将细胞团打散。

　　6. 在100ml或200ml通气旋转瓶中加入50ml旋转瓶wan全培养基-5，并将细胞悬液转移到瓶中。

　　7. 取出1ml细胞悬液，用血细胞计数器进行细胞计数。加入适量的旋转瓶wan全培养基-5，使细胞密度为（3~4）×105细胞/ml。将细胞放入无CO2培养箱，37℃旋转培养。

　　8. 随后的两天让细胞继续生长，并且每天对细胞进行计数，加入适量的旋转瓶wan全培养基-5以维持（3~4）×105细胞/ml的细胞密度。

　　9. 取1ml的细胞悬液，用血细胞计数器对细胞进行监测。

　　10. 当细胞密度达到（4~5）×105细胞/ml时，隔天或每天用培养基将细胞稀释至1.5×105或2.5×105细胞/ml。

　　11. 分别将装有50ml或100ml细胞悬液的100ml或200ml通气旋转瓶放入37℃无CO2培养箱旋转培养。每天或隔天传代。

　　二、注意事项

　　由于有些细胞是不能被养活的，所以需要高的初始密度。