免疫荧光的原理

免疫荧光（Immunofluorescence,IF）原理免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。

紫外光激发荧光物质放射荧光示意图免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（SlidesorCoverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。

固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或WesternBlot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响。

用于免疫荧光染色的染料需具备以下几个条件：

荧光染料应有较高的量子产额和消光系数；

荧光染料对488nm的激发光波长有较强的吸收；

发射光波长与激发光波长之间应有较大的波长差；

容易与被标记的单克隆抗体结合而不影响抗体自身的特异性。

1.异硫氰酸荧光素（FITC）：可产生亮绿色荧光。FITC是免疫荧光标记最常用的荧光探针。

2.德州红：与生物素偶联的抗体有很强的亲和力，产生红色荧光。

3.藻胆蛋白类：主要包括藻红蛋白（PE）、藻青蛋白（PC）、别藻青蛋白（APC）三类。多发生橙色至红色荧光。

4.能量传递复合染料