一、实验目的

(1)掌握蛋白质盐析沉淀的基本原理与操作。

(2)掌握蛋白质透析分离的基本操作。

二、实验原理

蛋白质是亲水胶体，借助水化膜和同性电荷(在pH7.0的溶液中一般蛋白质带负电荷)相互排斥作用维持蛋白质胶体的稳定，向蛋白质溶液中加入中性盐可破坏这些稳定因素，使蛋白质沉淀析出，称为盐析。盐析所得到的蛋白质沉淀经透析或用水稀释以减低或除去盐后，蛋白质能再次溶解并恢复其天然结构和生物活性，称为透析。由于蛋白质分子量很大，其颗粒直径范围在1～100nm内，不能透过半透膜。选用合适孔径的半透膜可使小分子物质透过，而蛋白质不能透过半透膜，从而可以除去与蛋白质混合的中性盐及其他小分子物质。蛋白质盐析常用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、NaCl等。蛋白质经盐析沉淀后，需脱盐才能获得纯品。脱盐最常用的方法为透析法。由于蛋白质分子量较大，不能透过半透膜，而无机盐及其他低分子物质可以透过，故利用透析法可将盐析得到的蛋白质进行纯化。将蛋白质溶液装入透析袋内，袋口用线扎紧，然后将其放进蒸馏水中，蛋白质分子量大，不能透过透析袋而被截留在袋内，而小分子盐由于透析袋内外浓度差，可透过透析袋，通过不断更换袋外蒸馏水，直至袋内盐分透析完为止。透析常需较长时间，为保证蛋白质不变性，透析宜在低温下进行。

三、实验材料与试剂

1.实验材料

10%鸡蛋清溶液，含鸡蛋清的氯化钠蛋白质溶液。

2.主要实验试剂

饱和硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵850g加入1000mL蒸馏水中，在70～80℃下搅拌溶解，室温放置过夜，杯底析出白色晶体，上清液即为饱和硫酸铵溶液。

硫酸铵晶体、1%硝酸银溶液等。

四、实验步骤

1.透析袋的预处理

为防干裂，新透析袋出厂时常用10%甘油进行处理，并含少量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，需除去。将透析袋剪成100～120mm的小段，用50%乙醇煮沸1h，再依次用50%乙醇、0.01mol/L碳酸氢钠和0.001mol/LEDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗3～5次(新透析袋如不作上述特殊处理，也可用沸水煮5～10min，再用蒸馏水洗净即可使用)。透析袋一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可用特殊的透析袋夹夹紧，从另一端灌满水，用手指稍加压，检查是否有渗漏，没有渗漏后方可使用。处理好的透析袋保存于蒸馏水中待用。

2.蛋白质盐析

取10%鸡蛋清溶液5mL于试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，蛋清蛋白质即可析出。如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液，观察蛋白质的析出。取少量沉淀的蛋白质，加水稀释，观察沉淀是否会再次溶解。

3.蛋白质的透析

注入含鸡蛋清的氯化钠蛋白质溶液5mL于透析袋中，将袋的开口端用线扎紧，并悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中，开口端位于液面之上。10min后，自烧杯中取出1mL溶液于试管中，加1%硝酸银溶液一滴，如有白色氯化银沉淀生成，则证明蒸馏水中有Cl-存在。再自烧杯中取出1mL溶液置于另一试管中，加入1mL10%氢氧化钠溶液，然后滴加1～2滴1%硫酸铜溶液，观察有无蓝紫色出现。每隔20min更换蒸馏水一次，数小时后可观察到透析袋内出现轻微混浊，此为蛋白质沉淀。继续透析至蒸馏水中不再生成氯化银沉淀为止。实验记录透析完成所需的时间。

五、注意事项

蛋白质溶液用透析除盐时，正负离子透过半透膜的速度不相同，如(NH4)2SO4中的透析速度快，而透析过程中膜内的会生成H2SO4，使膜内蛋白质溶液呈酸性。因此，为避免蛋白质变性，用盐析法纯化蛋白质时，开始时应用0.1mol/L的NH4OH透析。此外，为了保证蛋白质在透析过程中不发生变性，可以将透析过程置于低温下进行。