甘油菌种复苏保存涉及几个关键步骤，‌包括菌种的保存、‌复苏以及再次保存的过程。‌以下是详细的步骤和注意事项：‌

菌种保存：‌

将菌种接种于LB液体培养基，‌并在对数生长期时，‌当培养体系内浑浊可见时，‌进行保存。‌

准备50%浓度的甘油溶液，‌可以通过等体积的蒸馏水和甘油混合得到。‌

在无菌条件下，‌将菌液与50%浓度的甘油按1:1的比例混合，‌使甘油终浓度达到25%。‌

将混合液转移至2ml离心管中，‌并在-20°C冰箱内保存。‌这种条件下，‌菌种的保存有效期为1年。‌若需长期保存，‌建议在-70°C或-80°C下冻存，‌保藏时间一般为2-4年左右12。‌

菌种复苏：‌

在使用前，‌将保存的菌种在30°C水浴中解冻。‌

解冻后，‌将菌液接种到固体培养基上，‌并在适宜条件下培养24-48小时，‌以恢复菌种的活性。‌

再次保存：‌

复苏后的菌种可以在新的液体培养基中继续培养，‌并再次进行甘油保存。‌这一过程确保了菌种的长期保存和可用性。‌

注意事项：‌

确保所有使用的工具和容器都经过适当的灭菌处理，‌以避免污染。‌

在操作过程中保持无菌条件，‌以防止外界微生物的污染。‌

正确的保存和复苏方法对于保持菌种的活性和纯度至关重要。‌

保存的温度对菌种的长期存活有很大影响，‌低温条件有利于延长保存时间。