抗酸染色的基本原理：
分枝杆菌的植物细胞内带有很多的脂类，包围着在肽聚糖的外边，因此分枝杆菌一般不容易上色，要历经加温和增加上色时间来促进其上色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染剂融合后，就难以被酸碱性脱色剂褪色，故称抗酸染色。
齐-尼氏抗酸染色法是在加温标准下使分枝菌酸与石炭酸复红坚固融合成一氧化氮合酶，用盐酸乙醇解决都不褪色。当再加偏碱美兰复染后，分枝杆菌依然为鲜红色，而别的病菌及情况中的物质为深蓝色。

制片：
（1）涂片：左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。 拔或塞试管塞时，应将试管口通过火焰略加烧灼，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
（2）干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。
（3）固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。

染色：
（1）初染：滴加石炭酸复红溶液2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热5分钟，待标本冷却后用水冲洗。
（2）脱色：
（3）复染：用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗，用吸水纸吸干后用

油镜观察:
1、油不要滴太多
2、在调节焦距的时候要特别注意与载玻片之间的距离不要弄坏工具
3、调节时应该从下往上调节
4、在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。
5、用左眼观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。
如果不出现物象或者目标不理想要重找，在加油区之外重找时应按：低倍→高倍→油镜程序。在加油区内重找应按：低倍→油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜头。
6、油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。

结果判定:
1.干燥后油镜观察300个视野（观察时间不少于4min），抗酸性细菌呈红色，其它细菌或细胞呈蓝色
2. 报告方式
2.1 未找到抗酸杆菌
2.2 找到抗酸杆菌±：可疑，发现抗酸杆菌1-2条/300视野
2.3 找到抗酸杆菌1+：发现抗酸杆菌3-9条/100视野
2.4 找到抗酸杆菌2+：发现抗酸杆菌1-9条/10视野
2.5 找到抗酸杆菌3+:发现抗酸杆菌1-9条/1视野
2.6 找到抗酸杆菌4+：发现抗酸杆菌≥10条/1视野

质量控制：
每次用卡介苗做阳性对照
大肠埃希菌ATCC25922做阴性对照

注意事项：
1.每一玻片只能涂一份标本，以防脱落混淆
2. 脱色时间需根据涂片厚薄而定，厚片可适当延长，以无红色脱出为止
3. 冬季室温过低时，染色时间要适当延长
4. 有时同一个抗菌体上红色深浅也有不同，观察时应注意
5. 每次试剂用完后，请迅速盖好，以免挥发，储存时应避免高、低温及阳光照射
6. 在涂抹痰标本时，严禁对玻片加热
7. 染色时勿使玻片上的染液干燥