一、无菌准备
1、提前1个小时打开无菌室紫外灯消毒灭菌、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒;
2、将用于微生物培养的器皿、接种的用具和培养基等进行灭菌;
3、所有无菌操作都需在酒精灯旁操作。

二、培养基配置
1、LB肉汤:肉汤粉330g、5g葡萄糖、1000ml蒸馏水; .
2、营养琼脂培养基:琼脂培养基粉300g、5g葡萄糖、1000ml蒸馏水。

三、倒平板操作
1、将灭菌过的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰;
2、用左手将培养皿打开-条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10~20ml)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，轻轻摇匀。
3、等待平板冷却凝固(大约需5~10min) 后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。

四、平板划线操作
1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红;
2、在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞;
3、将试管口通过火焰;将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液;将试管口通过火焰，并塞上棉塞;
4、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。
5、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始 往第二区域内划线。重复以上操作，在三区域内划线。注意不要将最后一区域的划线与第一区相连。
6、将平板倒置，放入培养箱中培养。

五、稀释操作
1、将分别盛有9ml水的6支试管灭菌，并按10~10的6次方(打不出六次方来)的顺序编号。
2、用移液管吸取1ml培养的菌液，注入10倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。
3、从10倍稀释的试管中吸取1ml稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复第2步的混匀操作。依次类推，直达完成最后一支试管的稀释。注:移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰的1~2cm处。

六、涂布平板操作
1、将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中;
2、取少量菌液(不超过0.1ml)，滴加到培养基表面;
3、将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8~10s;
4、用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。

注意事项
1、将涂布器末端浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
2、操作中一定要注意防火!不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。

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